Công nghệ
TỔNG QUAN
Trong chiến lược Chấm dứt Lao, WHO kêu gọi làm xét nghiệm chẩn đoán Lao và phương pháp kháng sinh đồ, đồng thời cũng nhấn mạnh vai trò quan trọng của các phòng thí nghiệm thời kì hậu 2015 cho chẩn đoán nhanh nhiễm Lao và Lao kháng thuốc. Các phương pháp phân tử dựa trên công nghệ khuếch đại DNA như PCR đã được phát triển và áp dụng tại nhiều nước dùng cho chẩn đoán nhanh mầm bệnh Lao.
Bộ kit Loopamp (của hãng Eiken Chemical, Tokyo, Nhật Bản) dùng cho chần đoán Phức hợp vi khuẩn gây Lao (MTBC) sử dụng phương pháp LAMP – khuếch đại DNA đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp (loop-mediated isothermal amplification), thường được gọi là TB-LAMP. TB-LAMP là xét nghiệm thực hiện thủ công, thời gian xét nghiệm dưới 1 tiếng và đọc kết quả bằng mắt thường dưới đèn UV. Phương pháp TB-LAMP cần ít cơ sở vật chất để vận hành và tương đối dễ sử dụng nên trên thế giới hiện nay chúng đang dần thay thế cho phương pháp nhuộm soi ở nhiều Quốc gia đặc biệt là những nơi còn nhiều hạn chế về cơ sở vật chất. Công nghệ LAMP đã được sử dụng cho cả xét nghiệm các bệnh sốt rét và bệnh nhiệt đới.
Năm 2012 WHO lập ra Nhóm Phát triển Hướng dẫn (Guideline Development Group), đã công nhận TB-LAMP là phương pháp phân tử dùng cho xét nghiệm Lao, dễ dàng lắp đặt và ứng dụng ở các phòng xét nghiệm nhuộm soi với điều kiện có đã qua đào tạo ứng dụng công nghệ. TB-LAMP có nhiều ưu điểm như thông lượng tương đối cao, không yêu cầu các thiết bị khác dùng kèm và tiêu chuẩn an toàn sinh học giống với tiêu chuẩn của phương pháp nhuộm soi.
Từ năm 2012 đã có thêm 20 nghiên cứu ở 17 quốc gia. Tháng 1 năm 2016 WHO đã thành lập Nhóm Phát triển Hướng dẫn (GDG) mục đích để xem xét lại thông tin của hệ thống đánh giá và phân tích dữ liệu của từng người tham gia trong các nghiên cứu này. Các thông tin đã được đánh giá lại này và bản hướng dẫn chính sách chỉ áp dụng cho xét nghiệm TB-LAMP thủ công. Không đánh giá các xét nghiệm dựa trên cơ sở DNA. Theo chính sách của WHO, cần đánh giá công bằng minh bạch các xét nghiệm phức hợp vi khuẩn gây Lao (MTBC) sử dụng phương pháp LAMP hoặc khuếch đại DNA tại nơi sử dụng.
KIỂM TRA CHỈ SỐ
Phản ứng khuếch đại yêu cầu 4 kiểu mồi là phần bổ sung cho 6 vùng của gen mục tiêu (hình 1). Do DNA sợi kép sẽ trong điều kiện cân bằng động (dynamic equilibrium) ở nhiệt độ khoảng 65°C, một trong số các cặp mồi LAMP thể tham gia vào trình tự bổ sung của DNA sợi kép mục tiêu, bắt đầu tổng hợp DNA bằng DNA polymerase; phản ứng thay thế các sợi và giải phóng các DNA sợi đơn. Vì sự bắt cặp bổ sung của trình tự cuối đầu 5’ của cặp mồi nội xuôi vết tắt là FIP (Forward inner primer) và cặp mồi nội ngược viết tắt là BIP (backward inner primer) ở gần các vùng mục tiêu khuếch đại và hình thành cấu trúc vòng lặp (loop). Hoạt động này giúp hình thành nhanh và chính xác các cấu trúc đa dạng kích cỡ (trên cùng một sợi có trình tự đích đảo ngược lặp vòng thay thế).
Việc bổ sung các đoạn mồi vòng lặp, chứa trình tự bổ sung cho vùng lặp sợi đơn trên đoạn cuối đầu 5’ của cấu trúc xoắn (hairpin structure), giúp tăng tốc độ phản ứng bằng cách thêm số lượng lớn điểm bắt đầu tổng hợp DNA. Trong vòng 15 đến 30 phút số lượng bản sao có thể được khuếch đại 109 đến 1010 lần nếu sử dụng các đoạn mồi vòng lặp. TB-LAMP đã được đánh giá gồm các đoạn mồi vòng lặp của tổng 6 mồi liên kết với 8 khu vực. Đây là điều tất yếu để các trình tự đồng nhất ở các điểm đa liên kết giữ được độ đặc hiệu cao cho xét nghiệm ngay cả khi không có đầu dò.
Phương pháp LAMP tương đối không bị ảnh hưởng bởi sự kết tủa DNA và sản phẩm phụ của DNA (muối pyrophosphate), vì thế quá trình diễn ra liên tục cho đến khi sinh ra một lượng lớn amplicon. Việc này giúp chúng ta có thể xác định sản phẩm khuếch đại khi sử dụng thuốc nhuộm gắn DNA sợi kép (ví dụ như thuốc nhuộm SYBR green), quan sát dung dịch kết tủa magnesium pyrophosphate để đo độ đục hoặc sử dụng thuốc thử huỳnh quang có khả năng bị ức chế khi gặp cation hóa trị 2. Quan sát hình 2 ta thấy có thể dễ dàng đọc kết quả bằng mắt thường.
- Dùng pipet lỗ to để lấy 60 µL đờm vào hợp đựng rồi cho tiếp vào ống nhiệt có dung dịch tách chiết;
- Trộn dung dịch bằng cách đảo ngược xuôi ống khoảng 3 đến 4 lần, sau đó ủ ống ở nhiệt độ 90°C trong 5 phút để ly giải và bất họat vi khuẩn;
- Lấy ống ủ ra và để bên nguội trong 2 phút;
- Đưa ống ủ vào ống hấp thụ và lắc đều nhẹ nhàng đến khi bột hoàn tan hoàn toàn cùng dung dịch;
- Đặt nắp tiêm vào ống hấp thụ và vặn chặt để mở nắp;
- Chèn đầu phun và nhỏ 30 µl dung dịch vào ống phản ứng.
- Nhiệt độ hiển thị trên màn hình của máy ủ là 67°C;
- Đưa ống phản ứng vào buồng ủ và bắt đầu phản ứng;
- Quá trình khuếch đại tự động dừng sau 40 phút.
- Các ống phản ứng được đưa sang buồng đọc kết quả huỳnh quang, kết quả sẽ được lưu lại;
- Không được mở nắp mà phải xử lý các ống phản ứng theo quy định;
- Các rác thải khác cũng phải xử lý theo quy định của nước sở tại.
