Công nghệ

LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification): là một phương pháp mới hiện đang được dùng phổ biến để chẩn đoán nhanh trong lĩnh vực sinh y học dựa trên khả năng tổng hợp một lượng lớn DNA từ sợi đôi và tự quay vòng trong điều kiện đẳng nhiệt được thực hiện bởi một DNA polymerase đặc biệt có hoạt tính tách mạch và ít nhất hai cặp mồi đặc hiệu để nhận biết sáu trình tự khác nhau trên gen mục tiêu. Phương pháp này có hiệu quả khuyếch đại cao khoảng 10⁹-10¹⁰ lần trong 15-60 phút.

LAMP là phản ứng nhân bản DNA hết sức đặc hiệu, chỉ xảy ra khi có điều kiện cần và đủ cho phản ứng, đó là chỉ khi cả 4 chuỗi mồi, bao gồm các mồi đơn F3, B3, các mồi FIP (F1c+F2), BIP (B1c+B2) bám được vào 6 chuỗi đích của khuôn, thì sản phẩm DNA vòng mới được tạo ra và mới phát hiện được. Chỉ một hay vài mồi không hoạt động, hoặc không bám đặc hiệu, sản phẩm DNA vòng sẽ không được tạo ra. Đặc biệt sản phẩm của phản ứng có thể quan sát bằng mắt thường do sự kết tủa của phản ứng tạo muối pyrophotphate (Mg2P2O7) hoặc phát quang khi nhuộm bằng thuốc nhuộm.

Kỹ thuật RT-LAMP (reverse transcription Loop-mediated Isothermal Amplification) là một kỹ thuật dựa trên nguyên lý của LAMP chuyên dùng để phát hiện RNA.

 

II. Nguyên lý hoạt động

 

- Gene mục tiêu

- Bst DNA polymerase

- Các cặp mồi

 

Có 4 loại LAMP (cặp mồi) được dùng để nhận diện 6 khu vực riêng biệt của các gen mục tiêu khác nhau. Bốn loại cặp mồi bao gồm:

- FIP (Forward Inner Primer): Gồm 2 phần: vùng F2 (ở đầu 3’) là vùng bổ sung cho F2c và được nối với vùng F1c ở đầu 5’.

- BIP (Backward Inner Primer): Gồm 2 phần: vùng B2 (ở đầu 3’) là vùng bổ sung cho B2c được nối với vùng B1c ở đầu 5’.

- F3 (Forward Outer Primer): Chứa vùng F3, là trình tự bổ sung cho vùng F3c.

- B3 (Backward Outer Primer): Chứa vùng B3, là trình tự bổ sung cho vùng B3c.

 

 

a) Vùng đích của DNA: ba vùng đích “xuôi” (F1, F2, F3) cùng ba vùng đích “ngược” (B1, B2, B3) và các vùng bổ sung của chúng trên sợi đối diện.

 

b) Tách hai sợi DNA đích bằng cách biến tính.

FIP liên kết với vùng F2c.

Polymerase di chuyển dọc theo sợi (theo hướng 3 ‘đến 5‘) thêm các bazơ bổ sung.

 

c) F3 Primer liên kết với một vùng phía trước vị trí liên kết FIP.

 

d) F3 Primer tách sợi mới được hình thành do hoạt động của FIP trong khi nó tổng hợp DNA bổ sung.

 

e) BIP liên kết với sợi mới được giải phóng tại vùng B2c. Tổng hợp DNA bổ sung (theo hướng 3 ‘đến 5’)

 

f) B3 Primer liên kết với một vùng phía trước vị trí liên kết BIP (hướng 3’-5’)

 

g) B3 Primer tách sợi mới được hình thành do hoạt động của BIP trong khi nó tổng hợp DNA bổ sung. 

 

h) Các vùng F1/F1c và B1/B1c hiện đã liên kết với nhau tạo hình “quả tạ” với hai vùng vòng lặp. 

 

 

i) Liên kết FIP tại vùng F2c và tự mồi ở vùng F1 / F1c dẫn đến tổng hợp thêm các đoạn mới.

Giải phóng cấu trúc sợi đơn tự mồi (bổ sung cho cấu trúc của quả tạ ban đầu). 

 

j) Liên kết BIP và sự tổng hợp tiếp tục diễn ra.

 

k) Các vòng tổng hợp liên tục dẫn đến sản xuất số lượng lớn DNA, chứa nhiều lần lặp lại trình tự mục tiêu ban đầu.

 

2. Sản phẩm của phản ứng LAMP

Kết tủa magnesium pyrophosphate màu trắng đục có thể thấy bằng mắt thường và định lượng bằng việc chuẩn hóa thành phần MgSO4 để tính lượng ion Mg++ . Điện di trên gel agarose bằng thuốc nhuộm E.Bromide hay SYBR Green. Gắn huỳnh quang và cũng giống như phương pháp PCR định lượng (real-time PCR) dựa vào hàm lượng phát quang (fluorescence) sinh ra tương ứng với sản phẩm có từ khuôn.

 

III. Ứng dụng

1. Phát hiện mầm bệnh virus

Một số virus sử dụng phương pháp LAMP phát hiện như: Corona (SARS), Distemper, Herpes, Influenza, Japanese encephalitis, Measles, Mumps, Newcastle, Parvovirus, West Nile virus v.v…. Một số xét nghiệm LAMP đã được phát triển nhằm phát hiện mầm bệnh do virus gây ra ở người, động vật và cá. Đối với các tác nhân là virus, đa phần kỹ thuật RT-LAMP được ứng dụng để phát hiện. Những nghiên cứu này cho thấy sử dụng phương pháp LAMP cho độ nhạy tốt hơn so với phương pháp PCR hay nested PCR.

 

 2. Phát hiện mầm bệnh vi khuẩn

Một vài vi khuẩn gây bệnh đã được phát hiện thành công bằng kỹ thuật LAMP. Báo cáo đầu tiên vào năm 2004 bởi Savan đối với bệnh edwardsiellosis, một bệnh ở cá gây ra bởi Edwardsiella tarda ở Nhật Bản. Savan đã tạo một bộ bốn cặp mồi và tối ưu hóa chẩn đoán Edwardsiella tarda trong 45 phút ở nhiệt độ 65°C. Việc sử dụng gen haemolysin cho thấy, phản ứng LAMP có độ nhạy cao hơn so với PCR, không có phản ứng dương tính giả nào đối với 12 chủng vi khuẩn liên quan. Sử dụng 4 mồi của gen eip18 Yeh và cộng sự đã phát hiện nhanh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ở cá trê và không có phản ứng đặc hiệu xảy ra khi kiểm tra với 12 dòng vi khuẩn khác. Đối với vi khuẩn chủng E. coli, phương pháp LAMP cũng được sử dụng, trình tự mồi được thiết kế dựa trên các gen malB, gen stx2, v.v...

 

3. Phát hiện mầm bệnh ký sinh

Năm 2004, Ikadai và cộng sự đã sử dụng mồi được thiết kế từ gen 18S rRNA cho phương pháp PCR và LAMP để phân tích và phát hiện nhanh ký sinh trùng Babesia gibsoni ở chó. Phương pháp LAMP cũng được sử dụng để phát hiện nhanh các ký sinh trùng khác như: African trypanosomes, Plasmodium falciparum... So với phương pháp PCR, LAMP có độ nhạy hơn thậm chí tới 100 lần.